腺相关病毒生产荧光定量PCR反应对照梳理小结

　　荧光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。对照的目的是对检测的各个环节进行监控，因此我们按照检测的流程对对照进行梳理。常规荧光定量PCR的流程是：样品采集-运输-样品处理-核酸提取-反转录（RNA病毒）-扩增-结果读取。下面看看荧光定量PCR反应对照梳理小结：
　　1、阳性对照和阴性对照
　　腺相关病毒生产阳性对照和阴性对照是指在相同的处理条件下，比如一份已知的感染样品和一份已知的未感染样品，都进行了提取和扩增最终获得了阳性结果和阴性结果。阴阳性对照强调处理过程与样品一致，并且有明确的预期结果。
　　2.扩增对照
　　我们通常说的阳性对照和阴性对照指的是扩增试剂盒中附带的不需要提取的阳性对照和阴性对照，更准确的定义应该是扩增阳性对照和扩增阴性对照。扩增阳性对照含有阳性扩增模板，扩增阴性对照应含有阴性扩增模板（基质核酸）。扩增对照只能监控每次扩增过程中的扩增系统是否正常，不能监控采样、提取和每份样品的操作过程。如果是检测RNA样品的检测试剂盒，其扩增阳性对照使用质粒，便无法监控反转录过程。
　　3、内标（Internal Control，IC）
　　内标是指在同一反应管中与靶序列共同扩增的一段非靶序列分子。内标有两种形式，一种是使用天然样品中含有的内参基因作为内标，另一种是人工添加的内标。内标的最大特点是与靶序列共同扩增，而其他的对照都是独立扩增。
　　3.1 内参基因
　　通常它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。内参基因通常是持家基因（house-keeping gene）因为其表达水平受环境因素影响较小，而且在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达变化很小。常用的内参基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
　　内参基因的优点是与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序，可以监控采样，运输，核酸提取和扩增的全部过程。缺点是不同物种，不同生理状态下，不同组织中的内参基因存在一定的差异。如果样品类型是口腔液，咽拭子等样品，内参基因的量很低可能导致实验不成立。如果检测的是环境样品则内参基因可能完全失效。
　　3.2人工内标
　　添加一种不会干扰靶序列扩增的人工合成的内标。现在国外的诊断试剂盒大部分都会将内标直接添加在反应液中与模板一起扩增，但是这样的内标不能监控采样，运输和核酸提取的过程。
　　还有另一种形式的内标，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份样品中加入等量的内标，这样就可以监控样品的提取到扩增的过程。但是由于是人工添加到样品中，仍然不能监控胞内细菌病毒的释放情况。
　　4、核酸提取对照
　　可以使用内参基因，假病毒混合基质，灭活病毒混合基质来监控提取到扩增的流程。
　　5、反转录对照（RT control）
　　可以使用提取好的RNA内参基因，RNA假病毒混合基质，灭活RNA病毒混合基质来监控反转录到扩增的流程。
　　无反转录对照（no-RT control）含有除反转录酶以外的所有成分。