生物标志物分析Taq DNA聚合酶

　　生物标志物分析模板
　　（1）PCR反应必须以DNA为模板进行扩增， 模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好)。
　　（2）就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时，用量更少。
　　（3）灵敏的PCR可从一个细胞，一根头发，一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。
　　（4）模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
　　5.  Taq DNA聚合酶
　　一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。
　　Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30 min，掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100 μl PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。
　　所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。
　　反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验，需要预先灭活Taq DNA聚合酶， 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：
　　（1）PCR产物经酚:氯仿抽提，乙醇沉淀。
　　（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。
　　（3） 99-100℃加热10 min。目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
　　6.  反应缓冲液
　　（1）反应缓冲液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ 。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利于引物的退火。
　　（2）反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100 μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DN**段有利。
　　（3）各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。